mRNA展示技术：让蛋白与多肽药物筛选走上“高速路”
mRNA展示
图1 通过mRNA展示进行的体外筛选流程
构建大容量随机DNA库用于编码mRNA，并对DNA进行特殊加工：在5’端添加转录启动子（如：T7启动子）、翻译增强子、翻译起始密码子等序列；开放阅读框（ORF：通常包含固定和随机密码子的混合，需要根据目的蛋白而设计）；3’端不加终止密码子，并添加亲和纯化标签。
RNA转录并与嘌呤霉素连接
在体外利用RNA聚合酶将DNA转录成mRNA后，将mRNA的3’端和含嘌呤霉素的核酸片段偶联。
核糖体以带有嘌呤霉素的mRNA为模板进行体外翻译，并生成新肽链，嘌呤霉素进入核糖体A位点，肽链C末端与嘌呤霉素氨基连接形成酰胺键并中止体外翻译，使mRNA和新生肽链形成mRNA-肽复合物，并从含核糖体及其他成分的反应液中纯化出来。
图2 不同的DNA序列库设计和非天然氨基酸引入可构建不同的多肽库
cDNA逆转录，形成cDNA/mRNA-肽复合物
通过逆转录实时聚合酶链(RT-PCR)反应，对mRNA进行逆转录，从而得到与蛋白质结合mRNA的互补DNA链，即cDNA，生成cDNA/mRNA-肽复合物，以稳定核酸成分并加速筛选后基因信息的恢复。
筛选，分离
采用ELISA、磁珠法等，将目标靶点固定化于固相载体上，筛选出可特异性结合目标靶点的cDNA/mRNA-蛋白质融合体，并将无法结合的cDNA/mRNA-蛋白质融合体分离。
在高pH下将cDNA/mRNA-蛋白质融合体中的mRNA水解，释放cDNA链，并对cDNA进行PCR扩增，为下一轮筛选提供DNA模板或测序，这一阶段利用易错PCR可增加以扩增DNA为中心的序列多样性。
富集，得到目标蛋白和基因序列
依靠DNA库的多样性和靶点作用，在进行4～10轮筛选后，可富集高亲和力结合靶点的多肽序列。通过cDNA测序来确定多肽的结构。
为什么嘌呤霉素是 mRNA
展示的 “必选项”？
图3 嘌呤霉素连接mRNA-肽复合物示意图
（嘌呤霉素是氨酰化tRNA 3'末端的结构模仿物。嘌呤霉素与酪氨酸tRNA之间的差异以红色突出显示）
嘌呤霉素连接子的发展
将嘌呤霉素精准连接到 mRNA 的 3' 端，需要经过严谨的设计与操作，为提高嘌呤霉素与mRNA的连接效率，嘌呤霉素连接子逐渐得到了改进（图4）。
图4 mRNA-嘌呤霉素连接子制备方法比较
最初的mRNA展示通过夹板DNA，用T4 DNA/RNA连接酶连接mRNA和嘌呤霉素连接子，尽管嘌呤霉素连接子的投入量超过了mRNA 200倍，但这两种方法的连接效率仍然很低。
长生物素片段嘌呤霉素连接子（LBP）
为了解决mRNA展示的弱点（即低连接效率和mRNA不稳定性），通过在嘌呤霉素连接子中引入与mRNA和生物素的杂交区域，开发了mRNA展示的变体——cDNA展示（嘌呤霉素连接子包含一个反转录引物区域，因此在反转录反应中不需要添加引物）。嘌呤霉素连接子与mRNA的杂交可以通过T4 RNA连接酶提高连接反应的效率，因为嘌呤霉素连接子的5'末端和mRNA的3'末端是邻近定向的。
生物素用于将mRNA展示分子固定在磁珠上，易于清洗换液，去除干扰反转录反应的核糖体等物，以便于后续的反转录反应。生物素去除通常用LBP中的限制性内切酶位点。
更短的连接子序列迭代，降低DNA合成的成本，并提高mRNA与连接子的连接效率。利用RNase T1可特异性地在单链RNA的鸟嘌呤核糖核苷酸（G）后进行切割的原理去除生物素。
通过光交联制备的cnvK嘌呤霉素连接子
cnvK碱基的引入，有效减少了mRNA的降解，因为不再需要含有会激活污染核糖核酸酶的阳离子的T4 RNA连接酶反应缓冲液。在mRNA与cnvK嘌呤霉素连接子的光交联中，mRNA与cnvK嘌呤霉素连接子的混合比例为1:1–1.5，连接所需的时间约为1分钟。
mRNA展示筛选案例
mRNA展示技术因其更大的库容量、更可控的筛选调节、更短的实验周期等优势，成为多肽药物筛选库平台构建的新趋势。
MK-0616是默沙东借助Ra Pharmaceuticals的mRNA展示环肽库筛选出来的前体，后期经过药物化学家两年多的优化，成功将12个氨基酸的单环肽，变成8个氨基酸的三环肽。
2025年6月9日，默沙东宣布其口服PCSK9抑制剂enlicitide decanoate（MK-0616）治疗高胆固醇血症的两项关键III期研究达到了主要终点。这一成果标志着该药物有望成为全球首个口服型PCSK9抑制剂，为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）提供了新的潜在治疗选择。
Ra基于mRNA展示技术开发的另一款zilucoplan也于2023年10月被美国FDA批准上市，用于治疗重症肌无力。
结语
综上所述，mRNA展示技术凭借其巨大的突变体库容量、精准的基因-蛋白偶联能力和高度灵活的筛选策略，已经成为现代蛋白质工程和药物研发中的重要平台。嘌呤霉素在这一体系中扮演着不可或缺的“分子桥梁”角色，使得基因型与表型得以有效对应，大幅提升了筛选的效率与准确性。随着嘌呤霉素连接子技术的不断演进，mRNA展示体系在提高表达效率、稳定性和适用性等方面均取得了显著进步。近年来，通过这一平台诞生的创新药物不断涌现，推动了多肽药物和蛋白药物的快速发展。可以预见，随着技术的持续优化，mRNA展示将为新药发现、蛋白互作研究乃至生物医药产业带来更多突破性的进展。
瀚海新酶与mRNA展示
瀚海新酶生命科学解决方案
[1] Kamalinia G, Grindel B J, Takahashi T T, Millward S W and Roberts R W 2021 Directing evolution of novel ligands by mRNA display Chem. Soc. Rev. 50 9055–103
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