IVT工艺开发过程中，产物高产量与高完整度，是最先被关注的基础质量指标，高产量与生产成本息息相关，高完整度是产物质量的最基础指标。

T7 RNA聚合酶作为IVT翻译中最重要的原料，对于mRNA质量有决定性作用。瀚海新酶基于酶基因资源挖掘、酶定向进化、酶人工智能设计、酶大规模制造，以及酶催化体系的应用技术研发的五大技术平台，可提供mRNA合成全套物料，还可提供多种T7 RNA聚合突变体，并且基于对不同模板，不同突变体及IVT体系的深入研究，筛选并建立了自己的IVT Buffer库，满足客户各种生产需求及应用场景。

包封/装载工艺的基础是递送系统的设计开发。良好设计的递送系统才能使mRNA分子进入人体后避免被RNA酶降解、被有效递送至靶点、穿过细胞膜并在胞内释放。瀚海采用的是目前主流的脂质纳米颗粒的递送系统。

mRNA-LNP包封制备的关键，除了脂质成分配方外，就是工艺过程的控制了，即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程，以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。瀚海也是采用当前主流的微流控混合技术。由于mRNA溶于偏酸性水相，脂质体溶于乙醇，通过高压使mRNA溶液与脂质体溶液形成两股射流对冲混合，强烈的湍流使各组分充分混合，同时乙醇相被稀释，溶液pH变化，脂质体析出形成脂质纳米颗粒并与mRNA形成包封复合物。

mRNA包封后需要纯化去除未包封/装载的mRNA、游离的聚合物或脂质材料，并调整最终复合物浓度、置换溶剂缓冲体系、调节pH值等，此步骤通常通过切向流过滤实现，mRNA-LNP复合物被截留，杂质及溶剂被洗滤。以4000nt mRNA为例，包封后稀释20倍，利用中空纤维柱进行切向流过滤，下图工艺数据供参考。

将firefly luciferase mRNA-LNP递送到小鼠体内，数据显示mRNA-LNP成功表达在原位，靶向肝脏和脾脏。

以4000nt mRNA为例,纯化工艺相关数据如下：

瀚海新酶mRNA下游工艺的一般纯化流程及作用

下游工艺的纯化设计一般包括以下4个单元操作，可通过实施这些单元操作去除酶反应物、残留DNA和不需要的高分子量(HMW)物质等。

· 第一步UF/DF过滤。从接收IVT反应产物开始，然后UF/DF过滤器进行安装，用无核酸酶水冲洗，缓冲液平衡。接着将产物浓缩至目标体积，并洗滤置换到缓冲液中，最终通过对UF/DF组件进行清洗来回收产品。该操作的目的减少RNA聚合酶, DNA模板, NTPs, 加帽酶和试剂, 抑制剂等杂质, 并置换缓冲体系。

· 第二步是使用oligo dT填料捕获mRNA或者使用多模式核基球层析。前者以oligo dT(聚胸苷)配体(18-25 bp胸腺嘧啶脱氧核苷酸)和mRNA3'末端的聚腺苷酸(PolyA尾巴)通过氢键形成稳定的杂交以捕获mRNA。目的：去除缺乏PloyA尾巴的杂质如游离核苷酸、短链转录本、酶等。后者为mRNA流穿填料，将流穿和漂洗液收集为单个馏分，进入下一步骤。此步骤的目的是去除IVT反应组分污染物。

· 第三步是UF/DF过滤进行浓缩换液。将目标产物置换到最终制剂缓冲液中，并对UF/DF组件进行顶洗，以回收产物。

· 第四步也是最后一步，0.2µm除菌过滤。然后将封闭的药物底物原液灌装到无菌容器中。应该注意的是，任何不能被检测确认为无核酸酶的管路、层析或过滤部件需在环境条件下用0.5M NaOH保持至少1小时，然后用无核酸酶水和适当的缓冲液冲洗以用于下一单元操作。

最后，这些纯化过的mRNA药物底物原液可以进行下一步，即包裸到LNP中。

纯化工艺开发及数据展示

在mRNA领域，除了设计优化mRNA的序列与开发高效、安全的递送载体，开发简单、快速、大规模且兼具经济效益的mRNA制备工艺也是mRNA技术最重要的创新之一。在mRNA的生产工艺中，IVT后的纯化对于最终mRNA产品的安全性和有效性非常重要，因为杂质的含量会影响mRNA的翻译效率，并改变免疫原性。因此需要进行杂质的去除，相关杂质包括残留底物、dsRNA、异常mRNA、DNA模板、蛋白酶残留等。常用的纯化手段包括超滤、层析、沉淀等。